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近日，化学化工学院王家海教授团队联合广州市疾病预防控制中心何荣研究员、中国地质大学夏帆教授团队在纳米孔传感领域取得重要进展，开发了纳米孔计数器耦合PCR技术检测多种病毒核酸的方法，成果“Bare glassy nanopore for length-resolution reading of PCR amplicons from various pathogenic bacteria and viruses”为题发表在国际知名学术期刊Talanta上。

1、研究背景

传染性细菌和病毒，如严重急性呼吸综合征(SARS)、中东呼吸综合征(MERS)冠状病毒(MERS- CoV)、埃博拉病毒、SARS- CoV -2、登革热病毒、肺结核等仪表技术期刊，给人类健康带来了灾难性的后果和威胁。到目前为止，诊断这些病原体的金标准方法依赖于这些病原体每个独特基因的PCR扩增子荧光读出。同时，分子诊断结果的纳米孔读出正在迅速发展，并探索了许多可能性。由于纳米孔计数器具有计数短DNA双链的能力，而PCR可以产生大量设计长度的DNA双链，因此将这两种技术结合在一起比较直观。

2、研究内容

基于此背景，王家海教授团队联合联合广州市疾病预防控制中心何荣研究员、中国地质大学夏帆教授团队采用玻璃状纳米孔仪表技术期刊，在不添加任何有机添加剂或填充水凝胶的情况下，全面研究了199 ~ 2996碱基对范围内DNA双链的长度依赖性分辨率。研究发现，玻璃状纳米孔具有极好的区分至少200个碱基对分离的DNA双链的能力。长度大于2000碱基对的DNA双链堵塞电流峰值分布较宽，不适合进行多路复用研究。因此，多路复用研究的最佳选择是基于200 ~ 2000个碱基对的双链长度范围。长度在200到2000碱基对之间的DNA双链的纳米孔易位具有最好的电流特征，在定量和定性结果方面具有显著的性能。结果表明，5个不同长度、间隔超过200个碱基对的PCR扩增子，分别对应于Lambda DNA基因组的不同片段，可以同时被解析。设计长度的每个DNA双链的电流特征表明，较长的DNA双链具有较大的阻塞电流峰值幅值中值。此外，基于玻璃状纳米孔的长度分辨能力，可以在高分辨率下识别临床样本中包括SARS-CoV-2在内的各种致病菌和病毒。本产品的电子读出可以省去探针设计和荧光标签。

图1玻璃状纳米孔检测细菌或病毒基因PCR扩增产物方法示意图。

3、工作亮点

本研究有以下三个主要亮点：

1、在没有任何其他信号转换器(CRISPR-Cas12)的情况下，裸玻璃状纳米孔的检出限可降至7.5 aM，如实反映了PCR扩增的效率。

图2不同模板浓度下易位事件率。用两种BSA纯化方法，左图使用纯化试剂盒纯化，右图使用蛋白酶K消化。

2、裸玻璃状纳米孔用于从含有致病菌和病毒的临床样本中扩增的双链DNA PCR扩增子的长度依赖分辨。

图3玻璃状纳米孔对病毒或细菌四种不同基因PCR产物的鉴别能力。(a-d)易位信号电流-时间迹线、堵塞幅度随停留时间的散点图和堵塞幅度分布直方图，检测过程为将PCR产品稀释400倍后进行。(a)登革病毒capsid-membrane基因(290 bp)。(b) SARS-CoV-2 ORF8基因(569 bp)。(c)诺如病毒GII.4 [P31] ORF3基因(933 bp)。(d)猪链球菌分离株gadph基因(1027 bp)。

3、裸玻璃状纳米孔可用于筛选PCR效率最高的独特基因。

图4 玻璃状纳米孔SARS-CoV-2 Delta突变体中5个不同基因PCR产物的鉴别能力。(a-e)易位信号的电流-时间迹线、堵塞幅度随停留时间的散点图和堵塞幅度直方图，将PCR产品稀释400倍后进行检测。(a) ORF1ab基因(340 bp)。(b) S基因(383 bp)。(c) E基因(347 bp)。(d) M基因(379 bp)。(e) N基因(342 bp)。

4、研究相关

王家海教授、何荣研究员和夏帆教授为共同通讯作者，在国际知名期刊Talanta上发表题为“Bare glassy nanopore for length-resolution reading of PCR amplicons from various pathogenic bacteria and viruses”的研究工作，李慧珍副教授为第一作者，广州大学为第一通讯单位。