光学显微镜技术 qq买空间赞的平台讽刺领导讲话内容不清晰

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一、激光共聚焦显微镜的原理

传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰;激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。

二、转盘式碟片共聚焦显微镜的原理

普通显微镜，指宽场成像显微镜，所谓宽场成像就是“面成像”，所谓面成像就是一个时间点获得一整个二维图像，这是与明显区别于扫描成像显微镜的，如共聚焦显微镜。共聚焦显微镜是“点成像”，即每个时间点只能获得一个空间信息，通过不断花费时间去扫描最终获得整个二维或三维图像，因此扫描成像每个像点不是一个时间点，不管扫描速度有多快。目前市场的碟片共聚焦，属于二者综合性，因为使用多孔碟片，在一个时间点就可以多获得几个空间点信息，但是整个图像也不是一个时间点得到，部分空间信息是一个时间点得到。

转盘式碟片共聚焦是多点同步扫描，以Andromeda的转盘扫描头为例，转盘上分布有20000个螺旋排列的针孔，而激光光源覆盖约2000个针孔的范围(即扫描区域)，借助转盘的转动(针孔位置随之改变)，实现对样品的完整扫描，激发扫描区域内样品，发射光通过碟片上的针孔与激发光照射点共轭，滤除非焦面杂散光。相当于2000个激光点同步照射样品，同步激发，CCD上同步采集，所以扫描速度非常的快，可以实现每秒可以获得成百上千幅共聚焦图像的可能。碟片式共聚焦的最大优势是在图像质量能够接近甚至达到传统共聚焦分辨率的同时，获得活细胞快速变化的图像。

三、Andromeda的颠覆性光学设计

Andromeda 是转盘式共聚焦的突破性改进，由Till独家开发的Spining disk 转盘，该设计不同以往的双转盘碟片式共聚焦，而只用一个带针孔和聚光镜的转盘同时实现聚焦和扫描的工作。为持续高动态进程的三维成像，如细胞分裂、蛋白转运或相互作用、包囊运动等，提供了完美的多点式碟片共聚焦的解决方案。

四、激光扫描共聚焦显微镜的应用

(一)细胞的三维重建

普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。激光共聚焦能以50nm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法光学显微镜技术，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。激光共聚焦显微镜的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。

(二)静态结构检测：原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构

1.细胞原位检测核酸

用于细胞核定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色体定位观察。

2.测蛋白质、抗体及其他分子

位检测蛋白质、抗体及其他分子

疫荧光标记技术

测荧光蛋白

3.细胞凋亡

检测细胞凋亡不同时期细胞形态、细胞凋亡相关蛋白

4.观察及测定

探针可以直接跨过死细胞或活细胞膜，选择性地与特定细胞器结合

5.细胞融合

6.胞骨架结构

7.细胞间缝隙连接通讯

8.检测细胞内脂肪

尼罗红检测动物组织中或体外培养细胞内脂滴含量

(三)动态观察：活体细胞或组织功能的实时动态检测

1.实时定量测定细胞内钙的变化

钙离子浓度测定和比率成像

2.细胞内PH变化

同一种探针BCECF光学显微镜技术，分别用不同激发峰激发得到的荧光比例，探究PH变化

3.检测膜电位的变化

JC-1低电位下单体存在，发绿色荧光;高电位下J-聚集体，发红色荧光，随电位增加，红色荧光也增加

4.检测细胞内活性氧物种的产生

5.药物筛选

等跨膜进入组织或细胞过程及定位

病毒、细菌等荧光标记，检测是否进入、位置含量、动态过程

6.光共振能量转移-FRET

GFP和YFP，BFP和GFP等研究大分子间的相互作用

7.运输研究

利用胞吞/胞吐探针FM4-64，结合激光共聚焦、电镜、TIRF，检测囊泡的运动过程，探讨BFA对胞吞/胞吐过程的影响。

8.检测荧光漂白恢复

将待测细胞用荧光物质标记，淬灭;低强度激光扫描成箱，非淬灭分子移动，直接反映荧光标记物质及其结合物的运动，因此可用来研究缝隙连接通讯的快慢.